• Tobey Maguire vai Peter Parker / Người Nhện:
  Peter là vừa là một siêu anh hùng, vừa là một sinh viên ngành vật lý ưu tú của Đại học Columbia kiêm nhiếp ảnh gia cho báo Daily Bugle. Việc chấp nhận cuộc sống nhiều mặt này đồng nghĩa anh phải tạm từ bỏ trách nhiệm làm siêu anh hùng trong một khoảnh khắc nghịch cảnh. Khi Maguire ký hợp đồng đóng Người Nhện vào năm 2000, anh đã nhận được một bản hợp đóng ba phim.[8] Trong lúc ghi hình Seabiscuit vào cuối năm 2002, Maguire gặp phải chấn thương ở lưng và Sony đối mặt với khả năng tuyển lại một diễn viên mới cho vai Người Nhện.[9] Vì thế đã nảy sinh nhiều cuộc đàm phán liên lạc với Jake Gyllenhaal, nam diễn viên đang hẹn hò với Kirsten Dunst (Mary Jane Watson) ờ thời điểm đó để thay thế Maguire. Tuy nhiên, Maguire đã hồi phục và có thể đảm nhận vai diễn của mình với mức lương 17 triệu USD.[10] Sau này Maguire và Gyllenhaal sẽ thủ vai hai người anh em trong phim điện ảnh Brothers năm 2009.

• Kirsten Dunst vai Mary Jane Watson:
  Watson là người bạn mà Peter phải lòng từ khi anh còn nhỏ, nhưng anh buộc phải từ bỏ cơ hội ở bên cô vì bổn phận làm siêu anh hùng của mình.

• James Franco vai Harry Osborn:
  Harry là người lãnh đạo của tập đoàn Oscorp, con trai của Norman Osborn và người bạn thân Peter. Anh oán giận Người Nhện vì đã gây ra cái chết của cha mình.

• Alfred Molina vai Otto Octavius / Doctor Octopus:
  Octavius là một nhà khoa học và hình mẫu lý tưởng của Peter. Ông phát điên sau khi thất bại trong việc tạo ra một phản ứng nhiệt hạch tự duy trì. Cơ thể Octavius được gắn với thiết bị do ông điều khiển là bốn chiếc xúc tu trí tuệ nhân tạo bằng máy. Molina nhận vai Octavius vào tháng 2 năm 2003 và ngay lập lức bắt đầu tập luyện thể chất cho vai diễn.[11] Raimi từng bị ấn tượng bởi diễn xuất của ông trong Frida và cũng thấy rằng ông có thể chất tốt.[12] Molina chỉ bàn luận ngắn gọn về vai diễn mà không biết rằng ông là một ứng viên tiềm năng, vì thế ông rất hào hứng khi nhận vai bởi bản thân Molina là một người hâm mộ lớn của Marvel Comics.[13] Mặc dù Molina không hề quen thuộc với Doc Ock, ông tìm thấy một yếu tố trong truyện tranh mà ông muốn duy trì, đó là khiếu hài hước độc ác và mỉa mai của nhân vật.[14]

• Rosemary Harris vai May Parker, góa phụ của Ben Parker và người dì của Peter.
• J. K. Simmons vai J. Jonah Jameson, nhà quản lý và chủ tòa soạn hà tiện của tờ Daily Bugle. Jameson mang mối thù ghét cá nhân với Người Nhện khi ông coi anh là một tội phạm và không muốn để anh làm người hùng của thành phố.
• Donna Murphy vai Rosalie Octaviu, vợ và trợ lý của Otto Octavius. Bà đã mất mạng vì tai nạn khi giới thiệu thí nghiệm của chồng mình.
• Daniel Gillies vai John Jameson, con trai của J. Jonah Jameson và hôn phu của Mary Jane. Anh còn là một phi hành gia và anh hùng quốc gia.
• Dylan Baker vai Tiến sĩ Curt Connors, một trong những giáo sư dạy vật lý tại đại học của Peter và đồng nghiệp của Octavius.
• Willem Dafoe vai Norman Osborn, người cha đã qua đời của Harry, xuất hiện giống một ảo giác. Dafoe đưa ra ý tưởng này trong lúc quảng bá Người Nhện, khi ông so sánh ý tưởng với hình ảnh Vua Hamlet hiện hồn về ám ảnh con trai ông để trả thù cho ông.
• Mageina Tovah vai Ursula Ditkovich, con gái của người chủ căn hộ của Peter.

Cũng giống như phần trước, diễn viên Bruce Campbell có một vai khách mời, lần này trong vai một người chỉ chỗ ngồi trong chương trình của MJ. Nhiều năm sau, Jeffrey Henderson, người từng làm việc cho bộ phận storyboard của dự án điện ảnh Spider-Man 4 đã bị hủy, đã phát hành thông tin liên quan đến những kẻ phản diện sẽ xuất hiện trong bộ phim. Một trong những nhân vật như thế là nhân vật của Bruce Campbell phát triển thành Quentin Beck / Mysterio. Nhà đồng sáng tạo Người Nhện là Stan Lee thủ vai một người đàn ông trên phố cứu một người phụ nữ khỏi các mảnh vụn đổ nát trong một trận chiến giữa Người Nhện và Doctor Octopus. Scott Spiegel xuất hiện trong vai một người đàn ông cố gắng ăn một chút bánh pizza mà Người Nhện giao hàng. Phim còn có sự tham gia của rất nhiều diễn viên khác: Joel McHale vai một nhân viên giao dịch ngân hàng; Hal Sparks đóng một hành khách trong thang máy có một cuộc trò chuyện với Người Nhện; Donnell Rawlings vai một người dân New York la lớn rằng Người Nhện "đã ăn cắp bánh pizza của anh chàng" và Emily Deschanel vai một nhân viên lễ tân. Elizabeth Banks một lần nữa thủ vai Betty Brant, một trong những nhân viên của Bugle kiêm thư ký của J. Jonah Jameson. Daniel Dae Kim đóng một trợ lý của Doctor Octavius làm việc trong phòng thí nghiệm của ông. Aasif Mandvi xuất hiện trong vai Aziz, chủ một cửa hàng pizza địa phương; Joey Diaz đóng một khách hàng tương tự; Vanessa Ferlito vai một trong những người bạn diễn của Mary Jane. Joy Bryant xuất hiện trong vai một khán giả chứng kiến cảnh Người Nhện hành động; John Landis đóng một trong những bác sĩ phẫu thuật Doctor Octopus; Phil LaMarr vai một khách hàng trên tàu dễ dàng nhìn thấy ở bên trái Người Nhện (bên phải theo hướng người xem) trong khi người hùng sử dụng lưới nhện để làm chậm đoàn tàu; và Gregg Edelman thủ vai Bác sĩ David, bác sĩ tại Đại học của Peter và Peter đã tới gặp ông để nói về việc mất đi siêu năng lực của mình. Như từng tiết lộ trong cuốn phim blooper trong bản phát hành tại gia của Người Nhện 2, đạo diễn Sam Raimi có một vai khách mời (dù khuôn mặt của ông bị che đi), một trong những sinh viên làm túi rơi trúng đầu Peter khi anh đang nhặt bài tập về nhà của mình.